V sanatoriu REPROMEDA byla preimplantační genetická diagnostika (PGD) zavedena do klinické praxe ve spolupráci s oddělením genetiky a reprodukce Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v roce 2000.

Ihned v roce 2001 bylo dosaženo významného úspěchu - v červenci a srpnu se narodily první dvě zdravé děti počaté metodami asistované reprodukce s využitím preimplantační diagnostiky provedené v sanatoriu REPROMEDA. Bez aplikace této metody by byly s vysokou pravděpodobností ohroženy chromozómovou vadou a pravděpodobně by se vůbec nenarodily. Úspěchu si ceníme o to víc, že jde o první děti takto počaté nejen v České republice, ale i ve střední Evropě. V roce 2002 a 2003 se narodila řada dalších dětí a každý měsíc přibývají další páry, které otěhotněly právě díky této technice. V současné době spolupracujeme při diagnostice pomocí FISH a PCR se společností Genprogress s.r.o.  

Princip PGD

Metoda umožňuje diagnostiku vývojových vad nebo dědičných onemocnění ještě před zavedením embrya do dělohy. Jedná se doposud o jedinou preventivní metodu, která dokáže ještě před započetím těhotenství zabránit zplození postiženého dítěte a naopak dokáže pomoci vybrat k transferu takové embryo, které vyšetřovanou vadou nebo chorobou trpět nebude. PGD představuje pro rodiny s genetickou zátěží jedinou spolehlivou metodu k vyloučení přenosu závažných vad a dědičných chorob na potomky.

 

Rozdíl mezi prenatální diagnostikou a preimplantační genetickou diagnostikou

Prenatání diagnostika (PND) představuje soubor metod, které jsou oreintovány na rozpoznání již existující vývojové vady nebo dědičného onemocnění u plodu v časné fázi těhotenství. Smyslem v případě potvrzené vady je informování budoucích rodičů o vývojové vadě či chorobě, aby se mohlli zavčas (t.j. do konce 24. týdne těhotenství) rozhodnout, zda přijmou postižené dítě nebo zda požádají o přerušení těhotenství.  

Přestože se provedení screeningových metod prenatání diagnostiky díky moderním metodám posouvá do ranějších období těhotensví (kolem 12. týdne těhotenství), je kompletní diganóza uzavřena vždy až ve II. trimestru těhotenství, kdy u plodu proběhla celá organogeneze a většinou až v době, kdy žena již cítí pohyby plodu. Přerušení těhotenství v této fázi znamená velmi výrazný zásah do  mateřského organismu a již představuje velkou psychickou zátěž především pro ženu, ale  samozřejmě pro celý rodičovský pár i pro jeho nejbližší okolí. Ženy, které podstoupily indukovaný potrat, se k této okolnosti velmi nerady vracejí, některé se s tím dlouhodobě nemohou vyrovnat a prakticky 100% žen, které má tuto zkušenost, jednoznačně prohašují, že by nic podobného znovu již zažít nechtěly.

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je metodou preventivní, která brání početí nemocného a postiženého dítěte.

PND a PGD se vzájemně nevylučuje, tyto metody se naopak doplňují a v případě početí plodu po některých technikách PGD se ověření metodou prenatální diagnostiky doporučuje. 

 

Provedení PGD

Metoda PGD je vázána na cykly mimotělního oplození a nelze ji provést při přirozením otěhotnění. Provedení PGD vyžaduje nejprve odběr vhodného materiálu pro provedení vyšetření. Český zákon umožňuje odběr buňky (tzv. blastomery) z rýhujícího se embrya  a  proto se této techniky používá nejčastěji. Výhodou je možnost  vyšetření kompletního genomu, přeneseného z obou rodičovských pohlavních  buněk (z vajíčka i spermie).

 

 

Skupina obrázků dokumentuje získání blastomery z embrya pro účely preimplantační diagnostiky. K získání blastomery se používá přístroj zvaný mikromanipulátor, vybavený třemi držáky nástrojů. Na obrázku 1 vidíme prořezávání otvoru v zoně obklopující embryo, tímto otvorem vsune embryolog pipetu (obr. 2), kterou vysaje z embrya jednu blastomeru (obr. 3). Na obrázku 4 můžeme spatřit volnou blastomeru po jejím vypuzení z pipety.

(Obrázek - Archiv sanatoria REPROMEDA, r. 2001).

 

 

 

 

 

Metody PGD 

Pomocí PGD můžeme vyšetřovat buď chromozomální abnormity (s použitím metody FISH nebo nověji pomocí mikročipů) anebo genové mutace (tzv. single-gene defekty, pomocí metod molekulární diagnostiky).

Pokud chceme zjistit počet chromosomů nebo znázornit jejich úseky, je nejpoužívanější metoda FISH. Blastomera velikosti asi 0,02 mm je po odběru z embrya rozprostřena na mikroskopické podložní sklo, na němž je provedena příslušná procedura k současnému označení několika typů chromozómů fluoreskujícími sondami, znázorňujícími úseky DNA pro určitý chromozóm charakteristické.

V případě, že je cílem zjistit přítomnost mutace určitého genu, užívá se metody PCR (Polymerázová řetězová reakce). Pro tuto proceduru je potřeba z jádra blastomery vyizolovat DNA a podrobit ji příslušnému vyšetření. 

Materiál k vyšetření

K preimplantační diagnostice, jak bylo řečeno, se nejastěji užívá buněk embryí (blastomer), což umožňuje posoudit kompletní genom budoucího plodu (mateřský i otcovský oddíl). K vyšetření lze využít i polocytů (tzv. pólových tělísek) vajíčka. Toto vyšetření může však posoudit pouze mateřskou část genomu a využívá se jí v případě vyloučení chorob, jejichž nosičkou je matka, nebo k posouzení genetické kvality vajíček (vyloučení chromosomálních abnormit přenesených od matky). V případě screeningu aneuploidií (odhalení špatného počtu chromosomů) je toto však nutno označit pouze jako náhradní metodu, která se používá v zemích, kde zákon neumožňuje odebírat a vyšetřovat buňky z embryí.

 

Výsledky vyšetření pomocí FISH (Fluorescenční in-situ hybridizace)

Touto metodou lze vyloučit řadu chromozomálních abnormit, které způsobují těžké vývojové vady, z nichž některé jsou známy v podobě syndromů (např. Downův syndrom, Edwardsův syndrom, Patauův syndrom, apod.)

 

Normální ženský karyotyp.

Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře dva červeně označené chromozómy 13, dva modře označené chromozómy 18, dva zeleně označené chromozómy 21, a dva fialové X.
(Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

 

Normální mužský karyotyp. Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře dva červeně označené chromozómy 13, dva modře označené chromozómy 18, dva zeleně označené chromozómy 21, fialový X ažlutý chromozóm Y.
(Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

 

Karyotyp s trisomií X (v jejím důsledku vznikají vrozené vady spojené např. s nadměrnou výškou, menším obvodem hlavy a poruchami intelektu). Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře dva červeně označené chromozómy 13, dva modře označené chromozómy 18, dva zeleně označené chromozómy 21, a tři fialové X.
(Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

 

Karyotyp XXY - Klinefelterův syndrom - jeho nositel bývá neplodný. Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře dva červeně označené chromozómy 13, dva modře označené chromozómy 18, dva zeleně označené chromozómy 21, dva fialové X a žlutý chromozóm Y.
(Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

 

Karyotyp s trisomií 13. Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře tři červeně označené chromozómy 13, dva modře označené chromozómy 18, dva zeleně označené 21, fialový chromozóm X a žlutý chromozóm Y.
Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

 

 

Karyotyp s trisomií 18 (Syndrom poprvé popsaný Edwardsem a spol. 1960, spojený s potrácením a těžkými vrozenými vadami) - postižený plod výjimečně přežívá 1. rok života. Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře dva červeně označené chromozómy 13, tři modře označené chromozómy 18, dva zeleně označené 21, fialový chromozóm X a žlutý chromozóm Y.
(Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

 

Karyotyp s trisomií 21 Jde o poměrně často se vyskytující chromozómovou vadu - trisomii 21, která se projevuje Downovým syndromem. Na obrázku vidíme v rozprostřeném buněčném jádře dva červeně označené chromozómy 13, dva modře označené chromozómy 18, tři zeleně označené 21, fialový chromozóm X a žlutý chromozóm Y.
(Obrázek s chromozómy znázorněnými pomocí FISH ve fluorescenčním mikroskopu. Společný archiv sanatoria REPROMEDA a oddělení genetiky VÚVEL v Brně)

 

Vysvětlivky k textu:

Metoda FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) je používána ke znázornění úseků chromozómů v preparátu. Buněčné jádro je speciálním postupem rozprostřeno na podložní sklo, poté je provedena hybridizace, to je navázání sondy označené barevně fluoreskující sloučeninou. Sonda je připravena tak, aby se vázala právě jen na ten úsek desoxyribonukleové kyseliny, který chceme znázornit. Pokud znázorňujeme více chromozómů nebo jejich částí, použijeme sondy označené různými barvami.

• Metoda PCR (Polymerase Chain Reaction - polymerázová řetězová reakce) je při PGD používána ke zjištění mutací genů. Blastomera s buněčným jádrem je rozpuštěna ve speciální zkumavce, obsahující roztok s enzymy a dalšími látkami. V přístroji (termocyklér) je desoxyribonukleová kyselina ze získaného jádra pomnožena a poté je ve vzorku zjištěno, zda je přítomna desoxyribonukleová kyselina normálního nebo mutovaného genu, případně zda jsou přítomny markery ukazující na to, zda byl gen zděděn od rodiče s normálním nebo mutovaným genem.
• Jako blastomery označujeme buňky rýhujícího se embrya. Jako rýhující se embryo označujeme embryo od prvního dělení (1. den vývoje) do stadia moruly (4. den vývoje), kdy již dochází k těsnému spojení buněk, takže je nemůžeme v preparačním mikroskopu navzájem rozlišit. Pátý den vývoje dosahuje embryo obvykle stadia blastocysty.